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1958 · 桑格與胰島素的序列——中心法則的第一塊磚#

1958 諾貝爾化學獎：弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger，1918–2013，英國）——表彰「其對蛋白質胺基酸序列之研究，尤其是胰島素序列的測定」。他證明了蛋白質有唯一的、確定的序列，並因此開啟了分子生物學的中心法則。

懸案（案情提要）#

1950 年代中期，一樁被所有人認為「不可能」的任務擺在桌上：

把一個蛋白質的胺基酸「順序」讀出來。

為什麼說不可能？因為蛋白質有幾百個胺基酸殘基：

  • 化學家能知道總共有哪些胺基酸、比例為何（這靠水解與層析，見 1952-馬丁與層析法）；
  • 但「比例」不含順序資訊。同一組胺基酸，可以排列成天文數字般的不同序列；
  • 而每一步的降解都損失產量、引入誤差的機會隨步數累積——讀 100 個殘基，就要有 100 次分離與鑑定。

更根本的問題是科學哲學層面的：蛋白質究竟是不是「一條有固定順序的鏈」？1930–40 年代，膠體學派與化學派仍爭論不休（見 1953-施陶丁格與高分子）。若蛋白質是「巨分子」，則它的序列問題才有意義。

偵辦人：弗雷德里克·桑格。他選了最小的、胰島素——一個只有 51 個殘基的胜肽激素（兩個多肽鏈，21 與 30 個胺基酸，由二硫鍵相連）——作為突破口。

前因#

年份 事件
1918 桑格生於英國倫敦（父親是醫生）。
1939–1943 於劍橋，完成生物化學訓練；受阿爾弗雷德·米爾斯（Alfred Mills）與諾曼·霍里（Norman Hawry）的指導（霍里即 1937 年諾貝爾得主，見 1937-霍沃思與維生素C）。
1944–1946 戰時在倫敦醫學研究委員會從事有機化學研究；1946 年（26 歲）獲博士學位。
1948–1952 研究二硫鍵的化學（發現 \(\beta\)-苯甲醯基氯可裂解二硫鍵，且不破壞胜肽鏈）——這是「能切開蛋白質而留下可分析的片段」的關鍵技術。
1949–1955 研究自由基（\(\mathrm{H}\) 原子、羥基自由基）對胺基酸的氧化降解；發展DNFB 端基分析（桑格試劑，與 Edman 法是當時並行的兩套 N 端鑑定法）。
1952–1955 完成胰島素的二硫鍵橋與鏈分開（用 performic 酸氧化或苯甲醯基氯裂解），並定出 A 鏈與 B 鏈的胺基酸組成。
1955 發表胰島素 A 鏈的完整序列（史上第一條蛋白質序列）。
1958 獲諾貝爾化學獎；同年完成 B 鏈序列，胰島素全序列（51 個殘基）完成。
1961 與其團隊定出核糖核酸酶的序列（第一個有已知序列的酵素，見 1972-安芬森與核糖核酸酶）。
1977 發展DNA 定序法（桑格定序，以雙去氧核苷酸終止法為核心）；1980 年再獲諾貝爾化學獎（與伯格、吉爾伯特共享，見 1980-伯格與重組DNA）。
2013 逝於劍橋；劍橋的分子生物學實驗室（LMB）所在的「桑格大樓」以他命名。

調查#

偵查一：N 端鑑定——先找到「鏈的頭」。

桑格與同事（與他的博士生塔洛克（James Tuppy）合作）發明 DNFB 法（Sanger's reagent，1-氟-2,4-二硝基苯）：

\[\mathrm{H_2N{-}(N\text{-端殘基}){-}}\mathrm{蛋白質} + \mathrm{F_2N{-}C_6H_3{-}NO_2} \xrightarrow{\text{鹼}} \mathrm{F_2N{-}C_6H_3{-}NO_2{-}NH{-}(N\text{-端})\]

之後用酸水解，只有 N 端的胺基酸被標記（因為只有它的胺基是游離的）：

\[\text{酸水解} \xrightarrow{} \text{DNP-衍生的胺基酸（單一）} + \text{其餘胺基酸（游離）}\]

如此就能一次讀出一個殘基——這是「逐位讀序」的第一步。

偵查二：Edman 降解——桑格的方法與另一條路。

Edman 法（1952–53，由 Edman 提出，桑格將其發揚為可操作的序列策略）以苯異硫氰酸酯（PITC）與 N 端胺基酸反應，再以酸環化切下整個 PTH-胺基酸（一個完整的胺基酸被逐次切除而不破壞其餘的鏈）：

\[\mathrm{蛋白質{-}NH_2} \xrightarrow{\mathrm{PITC}} \mathrm{PTC\text{-}蛋白質} \xrightarrow{\text{酸}} \underbrace{\mathrm{PTH{-}胺基酸}_1}_{\text{被鑑定並移除}} + \underbrace{\mathrm{蛋白質}'_{-1}}_{\text{剩餘鏈}}\]

重複此循環，即可逐一讀出序列——這是「蛋白質有序列」最直接的證明。

偵查三：分段與重疊——把「讀不動」變成「讀得動」。

一條 30 個殘基的鏈無法靠一次降解讀完（產量會耗盡）。桑格的策略是分段 + 重疊：

  1. 用幾種不同的專一性裂解方式切出不同的片段（例如用胰蛋白酶切在 Arg/Lys 後、用胰凝乳蛋白酶切在 Phe/Tyr 後、用胰蛋白酶 + 化學裂解等）；
  2. 每組片段以層析分離並定序（見 1952-馬丁與層析法）；
  3. 比較不同酶切所得的片段，找出重疊區段，用「重疊法（overlap method）」拼出全序列。
\[\text{片段 A：} \; 1\!-\!8 \quad \text{片段 B：} \; 5\!-\!14 \quad \text{片段 C：} \; 12\!-\!20 \;\Longrightarrow\; \text{拼合得到 } 1\!-\!20\]

重疊片段的序列必須自洽——這提供了強烈的內部檢驗，任何錯誤都會在重疊處露餡。

偵查四：胰島素的特例——把二硫鍵橋解決掉。

胰島素的難題在於：它是由兩條鏈（A 鏈 21 殘基、B 鏈 30 殘基）以兩個二硫鍵相連組成的。序列測定前必須先決定：

  • 哪個半胱胺酸與哪個配對；
  • 兩條鏈的 N 端各是什麼。

桑格用過甲酸氧化（把二硫鍵氧化成磺酸，鏈間即分離）與苯甲醯基氯裂解（選擇性切斷其中一對二硫鍵）來解決，得到 A 鏈與 B 鏈各自的序列，並確定配對方式：

\[\text{胰島素：} \; \underbrace{\text{A 鏈（21 殘基）}}_{\text{GIVEQCCTSICSLYQLENYCN}} - \underbrace{\text{B 鏈（30 殘基）}}_{\text{FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT}} \quad (\text{兩個 } \mathrm{S{-}S} \text{ 橋})\]

「胰島素有唯一的序列」——這是本案的核心裁決。

偵查五：Edman 的挑戰與裁決。

桑格的方法面臨一個尖銳的批評（Edman 本人提出，並在 1960–70 年代引發長期的「定序論戰」）：Edman 降解每循環一次，肽鏈就縮短一個殘基，並非每一步都 100% 成功——所以讀 30 個殘基，就必須能辨認幾十個微量的 PTH-胺基酸，是否可靠？

桑格與其團隊（後來由布勞克斯托克（Broadstock）等人在 1960 年代以自動化的 Edman 降解器解決）用內部標準與統計方法建立了可信度：

\[\text{單次循環的鑑定正確率} \;\approx\; 99\% \quad \Longrightarrow\quad \text{30 循環後全序列正確率} \approx 0.99^{30} \approx 74\% \ (\text{需人工覆核與重複})\]

這場論戰最終以「自動化 Edman + 質譜鑑定（PITC-衍生物以質譜確認）」收束——方法的可疑性被統計與自動化共同化解，也是科學方法論的一個好教材。

理論裁決#

判決一：蛋白質有唯一確定的序列。 桑格的核心裁決：

\[\text{蛋白質} = \text{固定長度、固定組成的胺基酸序列} \quad (\text{一級結構})\]

這是中心法則的第一塊磚：序列 → 摺疊 → 功能 → 傳遞。若蛋白質是無序的膠體（膠體派的看法），則「序列決定功能」根本無從談起。1958 年的諾貝爾獎，實質上是一場關於「生命分子是否可被化學描述」的裁決，而答案是可以，而且精確到可以寫成一行字串。

判決二：重疊法的邏輯——唯一性由自洽性保證。 重疊法之所以可靠，在於它要求多條獨立的片段序列必須互相吻合：

\[\text{片段} A(1\!-\!8), B(5\!-\!14), C(12\!-\!20) \;\Longrightarrow\; A \cap B = (5\!-\!8), \ B \cap C = (12\!-\!14)\]

若任一讀序有誤，重疊區的吻合即破壞。這是一種「用交叉驗證建立可信度」的典範設計，其邏輯與 DNA 定序中的「重疊群（overlapping reads）」完全相同——DNA 定序（1977）正是把桑格的重疊法搬到核酸上。

判決三：序列分析的定量經濟學。 桑格的工作也建立了序列分析的「物料帳」概念：讀一條 \(n\) 殘基的鏈，需要的蛋白質量與時間隨 \(n\) 增長，因此早期只有胰島素（51 殘基）可行；自動化（Edman 降解器、蛋白質序列儀）與更靈敏的鑑定法（質譜）把可行長度推到數百、數千殘基。

\[\text{可讀長度} \;=\; f(\text{每循環產量}, \text{單次鑑定正確率}, \text{起始樣品量})\]

判決四：一級結構是「可攜的資訊」。 序列一旦寫下，就成了可攜、可比較、可搜尋的資訊——這是生物資訊學的起點：1970 年代的人類胰島素基因序列被讀出並於 1978 年在大腸桿菌中表現（人類胰島素成為第一個由細菌生產的藥品）。

後果#

領域 影響
分子生物學 「序列決定一切」的信念，是中心法則（1958）、遺傳密碼（1960–70 年代）、蛋白質生物合成機制（見 1962-佩魯茨與血紅蛋白 與 1972-安芬森與核糖核酸酶）的共同前提。
蛋白質化學 序列測定成為蛋白質結構與功能研究的標準前置；催產素與加壓素的序列（1955）開啟了「結構—活性」的比較研究。
生物技術 1977 年桑格定序法與 1980 年的重組 DNA（伯格）、DNA 測序（吉爾伯特）構成基因工程的技術三支柱；人類胰島素的基因工程化生產（1978）改變了糖尿病治療。
生物資訊 序列作為資訊的觀念，是 1970–90 年代序列資料庫與比較生物學的源頭。
科學制度 桑格是唯一兩度獲化學獎者之一（1958、1980），且是少數「連續兩次在同一領域得獎」的例子；劍橋分子生物學實驗室（LMB，1962 年成立）在他的領導下成為世界重鎮。

關聯#